COSY vs TOCSY : Comprendre les différences clés et comment interpréter les spectres

Pour l'analyse structurelle de molécules organiques complexes et de produits naturels, les expériences de RMN de corrélation scalaire homonucléaire 2D comptent parmi les outils les plus utiles pour résoudre les ambiguïtés causées par le chevauchement des signaux dans les spectres 1D.

Parmi les ¹H-¹H expériences de corrélation les plus largement utilisées, COSY et TOCSY répondent à deux questions différentes mais complémentaires.

COSY est principalement utilisé pour retracer la connectivité proton-proton locale via des couplages J observables, tandis que TOCSY étend le transfert de magnétisation à travers un réseau de couplage continu et aide à identifier tous les membres observables du même système de spin.

En termes pratiques, COSY aide à répondre à la question « Quels protons sont couplés entre eux ? », tandis que TOCSY aide à répondre à la question « Quels protons appartiennent au même système de spin ? »

Cet article passe en revue les deux expériences, des principes de séquence d'impulsions à l'interprétation pratique des spectres, en expliquant leurs différences clés et la manière dont elles peuvent être utilisées conjointement en spectroscopie RMN 2D.

1. Fonctions principales de COSY et TOCSY

COSY, ou spectroscopie de corrélation, et TOCSY, ou spectroscopie de corrélation totale, utilisent tous deux le couplage scalaire, ou couplage J, pour fournir des informations de corrélation de protons à travers les liaisons chimiques.

Cependant, le type d'informations structurelles qu'ils sont conçus pour révéler est différent.

Considérons une chaîne de protons couplés en continu :

H1 → H2 → H3 → H4

COSY : Connectivité de couplage locale

COSY détecte principalement les couplages scalaires directement observables entre des paires de protons.

Les corrélations les plus courantes proviennent du ²J_HH et ³J_HH couplages, par exemple :

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Ces corrélations par paires permettent aux chercheurs de construire la connectivité protonique locale étape par étape.

En d'autres termes, un spectre COSY est particulièrement utile lorsque l'objectif est de reconstruire la relation séquentielle entre des protons voisins ou autrement couplés de manière détectable.

Remarque : Les corrélations COSY ne sont pas limitées aux couplages à deux et trois liaisons. Dans les systèmes allyliques, les systèmes aromatiques ou les géométries rigides de type W, un couplage ⁴J suffisamment fort, généralement supérieur à environ 1,5 Hz, peut également générer un pic croisé COSY. Par conséquent, la présence d'un pic croisé ne doit pas être considérée comme une preuve que deux noyaux sont directement adjacents dans la structure moléculaire.

TOCSY : Attribution d'un système de spin complet

TOCSY adopte une approche différente.

Grâce au transfert de magnétisation à travers un réseau couplé en J, les protons au sein du même système de spin continu peuvent devenir corrélés même lorsque deux protons particuliers ne présentent pas de couplage direct fort l'un avec l'autre.

Son objectif principal n'est donc pas de déterminer la connectivité directe de chaque paire de protons. Au lieu de cela, TOCSY est utilisé pour identifier et regrouper plusieurs protons appartenant au même système de spin.

Par exemple, si H1, H2, H3 et H4 forment un réseau de couplage continu, la magnétisation peut se propager à travers la séquence :

H1 → H2 → H3 → H4

En conséquence, des corrélations entre des membres plus éloignés du système peuvent apparaître dans le spectre TOCSY.

Remarque : Un système de spin se compose généralement d'un groupe de noyaux connectés par un chemin continu de couplages J suffisamment forts. Si le couplage effectif entre des parties d'une molécule devient très faible ou est absent, le transfert de magnétisation peut être interrompu. Cela peut se produire lorsque des groupes sont séparés par un carbone quaternaire, certains arrangements d'hétéroatomes ou des géométries avec un angle dièdre proche de 90°, où le couplage devient très petit. Le résultat est la formation de systèmes de spin relativement indépendants.

2. Principes de la séquence d'impulsions

La différence fondamentale entre COSY et TOCSY provient de la manière dont le transfert de magnétisation est géré après la période d'évolution indirecte, t₁.

2.1 COSY

La séquence d'impulsions COSY de base peut être représentée comme suit :

90° - t₁ - 90° - Acquisition (t₂)

La première impulsion de 90° fait basculer l'aimantation longitudinale dans le plan transverse.

Pendant la t₁ période d'évolution, le déplacement chimique et le couplage J contribuent tous deux à l'évolution de la cohérence.

La seconde impulsion de 90° produit alors un transfert de cohérence direct.

La cohérence qui reste sur le noyau d'origine contribue au signal diagonal pendant la période d'acquisition t₂, tandis que la cohérence transférée vers un noyau couplé génère un pic croisé.

Le COSY conventionnel enregistre donc principalement des relations de couplage J directes par paires.

Dans le spectre, ces corrélations représentent généralement des protons voisins ou des protons géminés attachés au même carbone.

2.2 TOCSY

Le TOCSY introduit une période de mélange par verrouillage de spin supplémentaire après la période d'évolution t₁.

Le verrouillage de spin n'est pas simplement une longue impulsion RF. Il est généralement mis en œuvre à l'aide de trains d'impulsions composites tels que MLEV-17 ou DIPSI-2.

Pendant le temps de mélange, ces impulsions composites génèrent un mélange isotrope, permettant à l'aimantation de se propager à travers un réseau de couplage J continu.

L'aimantation se transfère d'abord entre des protons voisins directement couplés et peut ensuite continuer étape par étape à travers le système :

H1 → H2 → H3 → H4

Ce mécanisme de relais permet au TOCSY de corréler des membres plus distants du même système de spin.

Temps de mélange en TOCSY

La durée de la période de verrouillage de spin est appelée temps de mélange, et c'est l'un des paramètres les plus importants contrôlant la profondeur du transfert d'aimantation en TOCSY.

Temps de mélange court, par exemple 20 à 30 ms

Le transfert de magnétisation vient tout juste de commencer. Les corrélations sont dominées par les protons couplés à proximité, de sorte que le spectre résultant peut ressembler à un spectre COSY.

Temps de mélange modérément long, par exemple 60 à 100 ms

Il s'agit d'une plage généralement utile pour de nombreuses petites molécules et produits naturels. La magnétisation a plus de temps pour se propager à travers un système de spin continu, permettant à des membres plus éloignés d'être corrélés.

Temps de mélange plus longs

Plus long n'est pas toujours mieux.

Augmenter le temps de mélange peut permettre à la magnétisation d'atteindre des parties plus éloignées du réseau de couplage, mais la relaxation et les effets liés à la RF deviennent également de plus en plus importants.

T₂ La relaxation peut réduire l'intensité du signal, tandis que le chauffage RF et d'autres effets expérimentaux peuvent contribuer à la perte de signal ou à l'élargissement des raies. Dans certaines conditions de séquence d'impulsions et expérimentales, des périodes de mélange plus longues peuvent également augmenter les effets de relaxation indésirables ou les artefacts liés aux impulsions.

Pour cette raison, le temps de mélange TOCSY optimal doit être sélectionné en fonction de la taille moléculaire, de la topologie de couplage, du comportement de relaxation et du système de spin d'intérêt.

3. Comment interpréter les spectres COSY et TOCSY

Dans un spectre 2D ¹H-¹H, les deux axes représentent les déplacements chimiques des protons.

Les signaux le long de la diagonale correspondent aux résonances observées dans le spectre RMN 1D ¹H conventionnel.

Les pics croisés situés en dehors de la diagonale indiquent que la magnétisation a été transférée entre deux résonances de protons par des voies de couplage scalaire.

Selon l'expérience, ces corrélations peuvent représenter soit des couplages directs par paires, soit une connectivité au sein d'un système de spin continu.

L'exemple suivant utilise l'acétate de n-butyle pour illustrer l'interprétation pratique des spectres COSY et TOCSY.

3.1 COSY : Construire la séquence de protons étape par étape

Dans l'acétate de n-butyle, le carbone du groupe carbonyle n'a pas de proton attaché.

Il n'y a également aucune voie de couplage protonique continue observable entre le groupe méthyle acétyle et la chaîne n-butyle.

La chaîne n-butyle peut donc être analysée en utilisant une stratégie de traçage étape par étape.

• Commencez par le signal de proton le plus isolé vers les champs faibles, H2 à environ 4,0 ppm.
• Suivez la ligne horizontale à partir de H2 jusqu'à ce que le pic croisé H2 ↔ H3 soit trouvé à environ 1,6 ppm.
• Ensuite, revenez au signal diagonal H3 et recherchez sa corrélation voisine suivante. Cela révèle le H3 ↔ H4 pic croisé à environ 1,4 ppm.
• À partir de H4, poursuivez le même processus pour identifier la H4 ↔ H5 corrélation à environ 0,9 ppm.

En suivant ces pics croisés par paires individuelles, la séquence locale de connectivité protonique peut être reconstruite étape par étape.

Il est important de noter qu'il n'y a pas de corrélations majeures H2 ↔ H4 ou H2 ↔ H5 dans le spectre COSY.

Cela illustre l'une des différences les plus importantes entre COSY et TOCSY. Le COSY révèle principalement les relations de couplage par paires observables nécessaires pour construire le squelette protonique local.

3.2 TOCSY : Utilisation d'un signal d'ancrage pour identifier l'ensemble du système de spin

Pour un spectre TOCSY acquis avec un temps de mélange approprié, une stratégie d'interprétation différente peut être utilisée.

• Tout d'abord, sélectionnez une résonance protonique isolée comme signal d'ancrage. Dans cet exemple, H2 à environ 4,0 ppm est un ancrage pratique car il est bien séparé des autres signaux protoniques.
• Ensuite, tracez une ligne horizontale au déplacement chimique de H2.
• Le long de cette ligne, le pic diagonal H2 apparaît avec des pics croisés corrélant H2 avec H3, H4 et H5.
• En revanche, le proton méthyle acétyle H1 n'apparaît pas le long de cette trace.

Ces signaux peuvent donc être attribués au même système de spin n-butyle.

L'absence de H1 de cette trace indique que le groupe méthyle acétyle et les protons n-butyle appartiennent à des systèmes de spin différents dans ces conditions.

Cette approche devient particulièrement utile pour des molécules plus complexes.

Dans les peptides, par exemple, un signal NH amide ou un signal α-H peut être utilisé comme ancrage. Dans les oligosaccharides, le proton anomérique H-1 est souvent un signal d'ancrage particulièrement utile.

Dans ces systèmes, de nombreuses résonances protoniques intermédiaires peuvent se chevaucher dans une région étroite de déplacement chimique. Une attribution COSY étape par étape peut donc devenir difficile ou être interrompue par un chevauchement spectral important. Le TOCSY peut aider à contourner ce problème en permettant aux corrélations de s'étendre à travers le réseau couplé, rendant possible la classification des signaux en systèmes de spin même lorsque les résonances intermédiaires individuelles sont difficiles à distinguer.

4. COSY vs TOCSY : Principales différences en un coup d'œil

COSY et TOCSY ne sont donc pas des expériences concurrentes.

Elles fournissent différents niveaux d'informations structurelles et sont souvent plus utiles lorsqu'elles sont interprétées ensemble.

5. Foire aux questions

1. Un temps de mélange TOCSY plus long est-il toujours préférable ?

Non.

Pour les petites molécules conventionnelles, 60 à 100 ms constituent souvent une plage raisonnable pour commencer les tests.

Pour des échantillons plus complexes, il peut être utile d'acquérir deux jeux de données pour comparaison, par exemple un temps de mélange court de 20 à 30 ms et un temps de mélange relativement long de 80 à 100 ms.

Avec une courte période de mélange, le spectre est dominé par les corrélations entre protons proches. Une période de mélange plus longue peut révéler des corrélations plus distantes au sein du même système de spin.

La valeur optimale dépend cependant de plusieurs facteurs expérimentaux, notamment le couplage J, le comportement de relaxation, le solvant, la température, les performances de la sonde et la puissance RF. Le temps de mélange doit donc être optimisé pour l'échantillon spécifique et l'objectif expérimental plutôt que simplement maximisé.

2. Si aucun pic croisé n'est observé, peut-on conclure que deux protons ne sont pas adjacents ou apparentés ?

Non.

L'absence d'un pic croisé visible ne signifie pas nécessairement que deux noyaux ne sont pas apparentés.

Par exemple, selon la relation de Karplus, certains angles dièdres peuvent réduire de manière significative le ³ couplage J.

Un pic croisé peut également être difficile à observer s'il se trouve près de la diagonale et est masqué par les traînées diagonales.

Les protons échangeables peuvent subir un échange chimique rapide, entraînant un élargissement significatif des raies.

En TOCSY, un temps de mélange trop court peut également empêcher l'aimantation d'atteindre les membres les plus éloignés du système de spin.

Par conséquent, une conclusion de « pas de couplage » ne devrait pas être basée uniquement sur l'absence d'un pic croisé. L'interprétation doit également prendre en compte les modèles de couplage 1D, les données RMN 2D complémentaires et les paramètres d'acquisition utilisés pour l'expérience.

3. Quels sont les avantages des expériences à gradient amélioré telles que gCOSY et gTOCSY ?

Les gradients de champ pulsé, ou PFG, peuvent être utilisés pour sélectionner des voies de transfert de cohérence spécifiques et supprimer certains bruits et artefacts _t1.

Comparées à certaines expériences conventionnelles à cycle de phase, les séquences à gradient amélioré peuvent également réduire le nombre de balayages requis.

La quantité réelle de temps d'instrument économisé dépend de la séquence d'impulsions particulière et des paramètres d'acquisition.

La sélection par gradient ne peut cependant pas compenser les problèmes expérimentaux fondamentaux. Un mauvais shimming, un étalonnage imprécis des impulsions, une suppression inadéquate du solvant ou un échantillonnage insuffisant dans la dimension indirecte peuvent toujours compromettre la qualité spectrale. Une bonne configuration expérimentale de base reste essentielle pour obtenir des spectres COSY et TOCSY fiables.

Choisir entre COSY et TOCSY en pratique

COSY et TOCSY forment l'une des combinaisons les plus utiles en spectroscopie RMN 2D.

COSY aide à établir quels protons présentent des relations de couplage J observables directement, ce qui le rend particulièrement utile pour tracer la connectivité locale.

TOCSY aide à déterminer quels protons appartiennent au même système de spin, permettant aux chercheurs de regrouper les résonances apparentées même lorsque des pics intermédiaires individuels se chevauchent ou que des protons distants ne montrent pas une forte corrélation directe.

La clé est de définir la question structurelle avant de sélectionner l'expérience.

Si l'objectif est de tracer une séquence de protons locale, COSY est souvent le point de départ naturel. Si l'objectif est d'identifier les membres d'un système de spin couplé entier, TOCSY peut fournir les informations supplémentaires nécessaires.

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Lors de l'interprétation des spectres COSY ou TOCSY, la partie la plus difficile n'est souvent pas de collecter plus de corrélations, mais de comprendre exactement ce que chaque pic croisé indique et n'indique pas.